體外克隆目的基因的方法

相鄰片段的體外克隆目的基因法：

（1）PanhandlePCR法：

在限制酶消化的DNA3’端加一個與未知序列上游已知序列互補的單鏈引物，從而使經變性後產生的單鏈DNA分子內聚合，導致己知DNA定位於未知相鄰DNA側翼區段。引物設計是該技術運用的關鍵所在，所需引物包含-一個與已知序列上游互補的單鏈引物和兩對位於該單鏈引物兩側與己知序列一-致的引物。

（2）CassettePCR法：

利用Cassette及Casette引物特異性快速擴增cDNA及基因組DNA未知區域的一種有效方法。由於Cassette的5’端沒有磷酸基，在目標DNA的3’端和Cassette的5’端的連接部位形成缺口，在第一次PCR反應的第一循環時，從引物C1開始的延伸反應在連接部位終止，從而控制了非特異性的擴增。只有從引物S1開始延伸合成的DNA鏈，才能成為引物C1的模板，進行DNA的擴增反應。再用內側引物(引物C2，引物S2)進一步進行第二次PCR反應時，能高效特異性地擴增目的DNA。